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ER、PR在分化型甲状腺癌中的表达及意义

发布时间:2016-12-16      文章来源:未知

ER、PR在分化型甲状腺癌中的表达及意义
 
中文摘要
 
目的:本文旨在研究分化型甲状腺癌(DTC)患者性别、患者年龄,肿瘤的大小、是否有伴淋巴结转移、是否伴有包膜浸润以及肿瘤组织学类型与雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)的表达率之间的关系。
方法:选取2010年2月-2012年11月份在我院普通外科诊断为DTC的患者甲状腺手术标本共70例(乳头状癌61例,滤泡状癌9例),瘤旁正常组织22例,结节性甲状腺肿46例,甲状腺腺瘤17例,应用免疫组化(SP法)检测ER、PR的表达情况,并结合临床资料进行分析。
结果:DTC甲状腺组织ER、PR的阳性率分别为21.4%(15/70)、31.4%(22/70),正常甲状腺组织、结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤中几乎无ER、PR的表达(P < 0.01)。ER、PR表达水平与DTC患者甲状腺癌淋巴结转移及包膜浸润有关 (χ2 = 16.913,6.327,P < 0.05;χ2 = 7.516,12.727,P < 0.05),ER、PR表达水平与患者的性别、年龄,以及肿瘤大小及组织学类型无关(P > 0.05)。
结论:ER、PR在DTC患者甲状腺组织中表达水平高于甲状腺瘤旁正常组织、结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤,可能为DTC诊断及预后的判断提供临床参考。
 
 
关键词:分化型甲状腺癌、雌激素受体、孕激素受体
 
 
Expression and significance of ER and PR in differentiated thyroid cancer
 
                            Abstract
Objective: To investigate the relationship between the expression of estrogen receptor (ER) and progestogen receptor (PR) and gender, age, size of tumor, lymph node metastasis of differentiated thyroid cancer (DTC) patients
Methods 70 cases of DTC patients, archived in 2010-2012 were selected (61 cases of papillary thyroid carcinoma, 9 cases of thyroid follicular carcinoma), 22 cases of normal thyroid tissue near next to tumor tissue、46 cases of nodular goiter and 17 cases of Thyroid adenoma.The expression of ER/PR was detected by using the immunohistochemical staining technique (SP method)
Results The positive rates of ER/PR in DTC thyroid tissue were 21.4%(15/70), 31.4%(22/70) respectively, whereas no expression of ER/PR in most cases of normal thyroid tissue、nodular goiter and Thyroid adenoma. (P<0.01). The expression of ER/PR in DTC might be related to lymph node metastasis (χ2 = 16.913,6.327,P < 0.05;χ2 = 7.516,12.727,P < 0.05, respectively). No relationship was founded between expression of ER/PR and gender, age, size of tumor, and histology type(P > 0.05).
Conclusion The positive rate of ER/PR expression in DTC was higher than normal thyroid tissue、nodular goiter and Thyroid adenoma., which might be helpful in treatment of DTC in clinical practice.
Postgraduate: Chao-ming Zhang (General-surgery)
                                  Directed by prof: Wei-hua Li
 
Keywords: differentiated thyroid carcinoma, estrogen receptor, progesterone receptor
  
引言
      随着时间的推移甲状腺癌患者人数在我国大陆呈现出明显的增长趋势,乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌及未分化型甲状腺癌是甲状腺癌的最常见的类型,其中分化型甲状腺癌主要包括乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌,分化型甲状腺癌占甲状腺癌的大多数,约为80%--90%,众所周知分化型甲状腺癌的一个发病特点就是女性明显高于男性,大众调查研究也同样证实了这一点,甲状腺癌发病率确实存在着很明显的性别差异,女性患者大约为男性患者的3倍[1]。颈部常见的恶性肿瘤及颈部常见的内分泌肿瘤都以分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma,DTC)为主。众所周知,青壮年女性体内含雌、孕激素受体均高于男性。雌激素治疗常见的妇科疾病时可以使甲状腺癌的发病率增高,绝经后随着年龄增长患甲状腺癌的几率也随之下降,服避孕药的妇女可以增加甲状腺癌的发病率10】,因此,有学者推断雌激素、孕激素与其特异性受体ER、PR的结合可能参与了DTC疾病的发生发展[2]。现国内外大量研究已证实并得到国内外专家的公认:ER、PR在其靶器官乳腺癌的发生发展及预后有明显的关联,并且对雌激素受体及孕激素受体阳性的患者进行内分泌治疗后,乳腺癌患者的预后得到明显的改善。但最近也有报道表明ER、PR不仅存在于雌孕激素靶器官正常组织及肿瘤中,也存在于非靶器官正常组织及肿瘤中,如肺癌、胃癌、肝癌及甲状腺乳头状癌中,ER、PR于非靶器官肿瘤的发生、发展及预后有一定关系,但在其肿瘤中ER、PR的表达量不同【12】。分化型甲状腺癌的诊断主要通过术中冰冻及术后病理得到明确诊断,术前诊断率较低,有文献报道ER和PR可作为分化型甲状腺癌的辅助诊断指标,尤其是术前针刺细胞学的诊断对甲状腺癌的良恶性鉴别有一定的帮组,针刺细胞学对甲状腺癌的诊断率约为75%,若结合ER、PR对甲状腺癌的诊断率有望提高到90%【13】,也有学者预测三苯氧胺可能为雌激素及孕激素受体阳性的甲状腺癌术后提供一种新的治疗方法【11】,但ER和PR对DTC的形成是否有直接的作用目前尚不明确。本研究拟通过检测DTC患者甲状腺癌组织中ER、PR的表达水平,探讨二者在分化型甲状腺癌中发生发展及雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达水平与分化型甲状腺癌(DTC)患者性别、患者年龄,瘤体大小、是否伴有淋巴结转移、是否伴有包膜浸润及肿瘤组织学类型的关系。通过此项研究为分化型甲状腺癌的临床诊断、甲状腺疾病治疗及判断患者预后打下一定基础。
第1章 实验材料与方法
1.1 一般资料
      选择取2010年2月-2012年11月在我院普通外科经术后病理诊断证实的DTC患者甲状腺切除术后的标本共计70例。其中甲状腺乳头状癌手术标本61例,滤泡状癌手术标本9例。患者年龄22-76岁,平均42 ± 6.7岁,其中男性21例,女性49例。按《2012分化型甲状腺癌诊治指南》进行手术标本划分。30例为大于45岁患者,40例为小于45岁患者,癌组织直径 >1cm 18例,直径 <1cm 52例;有淋巴转移的甲状腺癌患者16例,无淋巴转移患者54例,伴包膜浸润16例,无包膜浸润54例。除此之外,选取瘤旁正常组织22例、结节性甲状腺肿46例,甲状腺腺瘤17例作为实验对照。
1.2主要仪器及试剂来源
(1)鼠抗人PR、ER单克隆抗体:广东大华生物科技股份有限公司
(2)SP试剂盒:广东大华生物科技股份有限公司
(3)DAB显色盒:广东大华生物科技股份有限公司
(4)抗体稀释液:广东大华生物科技股份有限公司
(5)苏木精,盐酸酒精液:广东大华生物科技股份有限公司
(6)无水酒精、80%、95%酒精及二甲苯:北京中山化工有限公司,
(7)3%过氧化氢溶液:北京中山生物技术有限公司
(8)柠檬酸盐抗原修复试剂:上海福州生物股份有限公司
(9)0.01mmol/L的磷酸盐缓冲试剂(PBS):广东大华生物科技股份有限公司
(10)封片剂、载玻片、盖玻片:北京中山生物技术有限公司
(11)光学显微镜:日本ALYMPUS公司
(12)烤箱:上海浦东越新科技仪器厂
(13)冰箱:NATIONAL公司
(14)微波炉:NATIONAL公司
(15)其他均有我院病理科提供。
1.3主要试剂配制
(1)75%酒精:无水酒精375ml加入蒸馏水125ml混匀。
(2)0.9%的生理盐水:18gNacl溶解于2000ml蒸馏水中并混匀。
(3)4%多聚甲醛溶液:量取30g多聚甲醛,放入烧瓶中,并在烧瓶中加入500~700ml  0.1mol/L磷酸缓冲试剂(PB),加热温度为60℃左右,摇晃烧瓶使粉末完全溶解于溶液中,最后加0.1mol/L的PB 300~500ml使溶液达到1000ml,混匀并调节溶液的PH至7.3左右。
(4)0.01M PBS (pH7.2-7.4) 氯化钠 8g  ,KCL  0.2g, 磷酸二氢钠   1.44g, KH2PO4  0.24g,溶于600ml蒸馏水,用稀盐酸调节PH值至7.2-7.4,最后加蒸馏水至1L,室温保存。
(5)0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)
贮存液 A :0.1M柠檬酸钠(Na3C6H5O7.双氧水): 28.41g溶于900ml蒸馏水;B :0.1M柠檬酸(C6H8O7.双氧水):20.0g溶于1000ml蒸馏水;
工作液 :量9.5ml的贮存液 A 、40ml的贮存液B,蒸馏水补充至500ml
(6)无水酒精、二甲苯等试剂均来自国产正规公司。
 
1.4实验方法
1.4.1甲状腺癌组织标本切片制备
入组的甲状腺癌患者标本都通过免疫组织化学SP法进行检测,将入组的每一个标本都经10%中性福尔马林固定,标本用酒精常规脱水,石蜡包埋标本,连续4um切片,将术后标本分别进行严格的HE和组织化学SP法进行组化染色。用已知阳性片作为阳性对照,阴性片作为阴性对照,PBS作为一抗的空白对照。
1.4.2HE染色步骤
(1)、将选好的石蜡切片脱蜡水化。
(2)、把切片放入苏木精中染色15-20min。标本染色时间主要由当时的室温、染色剂的成熟程度而决定标本染色时间长短。
(3)、把切片用自来水冲洗约10min,直至切片颜色变蓝。
(4)、把标本放入1%酒精溶液中褪色,时间根据褪色程度一般控制在2秒至数十秒钟之间。
(5)、漂洗,再一次把切片放入自来水中使其重新恢复蓝色。
(6)、脱水Ⅰ,将切片依次放入50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇中各5min。
(7)、复染,用0.5%伊红乙醇溶液对比染色约2min。
(8)、脱水Ⅱ,将切片放入95%乙醇中,再将其放入无水乙醇中约3-5min。吸干乙醇。
(9)、透明,将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5min。
(10)、中性树胶封存
 1.4.3免疫组化染色步骤
(1)标本的脱蜡和水化,将选好的标本切片放入60摄氏度的烤箱中,时间一般为20min,保证蜡充分熔化。将标本放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ10min进行脱蜡。再将切片分别放入100%、90%、80%、70%酒精溶液中,时间控制在5min,左后放入蒸馏水水化。
(2)将切片加一滴3%过氧化氢,在室温下孵育10分钟,蒸馏水冲洗多余过氧化氢。
(3)将标本浸入装有0.01缓冲试剂的染色缸内,加热到90℃左右,保持温度约30min,取出切片后使之自然冷却。
(4)0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液洗3次,每次大约2min。
(5)去除标本表面的PBS液,切片加入一滴一抗(ER、PR鼠抗人单克隆抗体),在室温下孵育60分钟。0.01M PBS冲洗3次,每次大约3min。
(6)去除PBS液,每张切片加1滴试剂1,室温下孵育约15分钟,0.01M PBS冲洗3次,每次约3min。
(7)以同样方法滴加试剂2
(8)用DAB显色剂染色大约10min,蒸馏水冲洗DAB显色剂,梯度酒精脱水干燥,透明后进行封固镜检。
1.4.4结果判读
阳性细胞的判定为:在细胞的胞浆或胞核出现棕黄色颗粒。阳性细胞半定量标准:观察每张切片上、下、左、右及中五个高倍镜视野,其中“-”为无阳性反应,“+” 为阳性细胞数l%-20%;“++” 为阳性细胞数20%-50%,“+++”为阳性细胞数>50%。病理片由两位有经验的病理医师双盲下观察并作出诊断。
1.5统计学处理
所有数据均通过SPSS 19.0进行统计处理,计量资料用U±S表示,计数资料用百分率表示。应用χ2检验、t检验进行统计学分析, P<0.05认为差异有显著性。
 
第2章    结果
2.1免疫图片
   
           图1:乳头状癌组织中ER表达阳性。(100X)
 
           图2:滤泡状癌中ER表达阳性。(100X)
 
           图3:乳头状癌中PR表达阳性。(100X)
 
          图4:滤泡状癌中PR阳性表达阳性。(100X)
 
          图5:结节性甲状腺肿PR阴性表达(100X)
 
          图6:结节性甲状腺肿ER阴性表达(100X)
       
          图7:甲状腺腺瘤PR阴性(100X)
     
          图8:甲状腺腺瘤ER阴性(100X)
 
          图9:瘤旁正常组织ER阴性(100X)
     
          图10:瘤旁正常组织PR阴性(100X)
2.2ER、PR在DTC癌组织中的表达情况及瘤旁正常组织中的阳性率
    ER、PR主要定位于细胞质及细胞核中。70例分化型甲状腺癌中ER、PR的阳性率分别为21.4%(15/70)、31.4%(22/70)。瘤旁正常组织、结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤未见ER、PR的表达。
2.3分化型甲状腺癌ER、PR的表达与淋巴结转移及包膜浸润情况
雌孕激素受体在伴有淋巴结转移的分化型甲状腺癌表达率分别为62.5%、62.5%,无淋巴结转移的分化型甲状腺癌表达率分别为9.2%、22.2%,两者比较有统计学意义(χ2=16.913, 7.516 P<0.05);有包膜浸润的分化型甲状腺癌表达率分别为16.9%、23.7%,无包膜浸润的分化型甲状腺癌表达率分别为45.4%、72.7%,两者比较有统计学意义(χ2=6.327,12.727 P<0.05)。
2.4分化型甲状腺癌ER、PR的表达与性别及组织学类型情况
  雌孕激素受体在男性分化型甲状腺癌表达率分别为19.0%、28.5%,在女性分化型甲状腺癌表达率分别为22.4%、32.6%,两者比较无统计学意义(χ2=0.942,0.116 P >0.05);在乳头状癌表达率分别为19.6%、31.1%,在滤泡状癌表达率分别为33.3%、33.3%,两者比较无统计学意义(χ2=1.653, 0.913 P >0.05)。
2.5分化型甲状腺癌ER、PR的表达与肿瘤大小及年龄情况
   ER、PR在肿瘤直径>1cm分化型甲状腺癌表达率38.8%、44.4%,在肿瘤<1cm直径的分化型甲状腺癌表达率分别为19.0%、33.3%,两者比较无统计学意义(χ2=0.353, 0.176 P>0.05)。在患者年龄>45岁的分化型甲状腺癌表达率分别为20.0%、30.0%,在患者<45岁分化型甲状腺癌表达率分别为22.5%、32.5%,两者比较无统计学意义(χ2=0.063, 0.049 P>0.05)。
 
第3章 讨论
3.1 ER、PR与分化型甲状腺发病关系
        甲状腺癌是常见的颈项部肿瘤,也是女性的常见恶性内分泌肿瘤之一,甲状腺癌的发生是一个复杂的过程,由多基因协调、多因素作用,经历复杂生物学步骤才能发病。甲状腺癌的发病可能与患者膳食习惯有关(食物含高碘或缺碘),雌激素、孕激素分泌增加,长期接触史发射线,患者家族遗传等因素有关,或其它由甲状腺良性疾病如结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤恶变导致[3]。分化型甲状腺癌的主要治疗方法是手术治疗,术后给予甲状腺素的治疗,甲状腺癌的术后甲状腺素的治疗有两方面的原因,第一是由于甲状腺术后甲状腺素的分泌量不足以满足人体的正常需求,需给予外来的甲状腺激素代替治疗,以满足人体的正常需求。第二个重要的原因就是T3、T4可以作用于下丘脑—垂体—甲状腺素轴从而抑制垂体分泌的TSH,高水平的TSH可以明显的降低甲状腺癌的术后复发率【14、15】,多数国内外专家认为:雌激素、孕激素可以使腺垂体对TRH的敏感性加强,从而通过负反馈机制影响垂体分泌的TSH而间接的作用于甲状腺,影响甲状腺癌的发生【16】。雌激素、孕激素除通过增强腺垂体对TRH的反应,从而反馈影响垂体分泌的TSH而间接的作用于甲状腺,影响甲状腺癌的发生外【16】,还可能通过以下机制影响分化型甲状腺癌的发生:1)雌激素、孕激素通过与其受体结合,激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,增强有丝分裂;2)通过ER、PR向核内传递信号,上调细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平,增加甲状腺癌组织的增殖;3)激活Ras-Raf-MAPK信号通路等[5]
3.2 分化型甲状腺癌、甲状腺良性病变及正常组织ER、PR表达的关系
      分化型甲状腺癌发病率女性明显高于男性,流行病学调查研究表明,甲状腺癌发病率存在明显的性别差异,女性约为男性的3倍[1]。本实验分化型甲状腺癌标本共计70例,其中男性21例,女性49例,女性约为男性的2倍,这与上述流行病学及文献报道相似。本研究结果显示,DTC癌组织中可检测到ER 与PR的表达,其表达率分别为21.4%(15/70)、31.4%(22/70),而正常甲状腺组织、结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤中未见上述两种受体的表达。国外部分文献认为甲状腺癌组织的雌孕激素表达率明显高于正常甲状腺组织及良性的甲状腺病变,其中雌孕激素在分化型甲状腺癌的表达率分别为30.2%、36.5%[4],与本研究结果相同。提示ER、PR可能在部分分化型甲状腺癌的发生发展中起到一定作用。但也有文献报道ER、PR在分化型甲状腺癌的表达率分别为:48%、52.2%【18】,明显高于本实验研究的表达率21.4%(15/70)、31.4%(22/70),造成此结果的原因可能为实验结果判定标准、染色方法的不同及本研究标本量不足等造成。
3.3 ER、PR与分化型甲状腺癌肿瘤大小的关系   
        本研究结果提示在DTC肿瘤中雌孕激素阳性表达情况为:大于lcm甲状腺癌组织明显高于直径小于1cm,即分化型甲状腺癌组织中ER、PR的表达水平和肿瘤大小存在一定的关系,而组织学类型、性别、年龄等与ER、PR的表达多少无关,提示ER、PR可能通过某些复杂途径参与了DTC 的发生及发展。雌、孕激素通过与ER、PR结合,激活下游信号通路,刺激甲状腺癌细胞的增殖和生长,使G0/G1期细胞减少,S期细胞增多,引起肿瘤细胞的过度生长增殖,促进肿瘤的发生发展。并且随癌组织体积不断增大,ER、PR受体的表达水平及阳性率也不断增高。
3.4 ER、PR与甲状腺癌患者年龄、性别的关系
        近年国内外学者应用免疫组化等方法对ER、PR在年龄、性别方面的研究结果尚无统一意见[6]。本研究结果提示ER、PR的表达与患者的性别差异无统计学意义,除外遗传和环境因素,造成男女DTC患者患病率不同的具体机制可能与受体的亚型、激素水平及受体对激素反应的敏感性不同有关。年龄是甲状腺癌预后的重要影响因素,大于45岁的患者预后明显差于年龄小于45岁的患者,雌孕激素及其受体在年轻人群中浓度较高,而随年龄的增长尤其到绝经后的女性体内雌孕激素及其受体水平显著下降,本研究显示年龄大于45岁患者ER、PR的表达率低于年龄小于45岁的患者,与上述研究一致,这从侧面反映了随着年龄的增长雌孕激素受体的减少,ER、PR对甲状腺癌的发生发展的影响也随之降低。雌激素受体(ER)包括两种分子亚型,即:ERα、ERβ,两种亚型发挥着不同的作用,在肿瘤的发生机发展工程中甚至起到相反的作用,ERα基因定位于染色体 6q25-1,在恶性肿瘤发挥促进癌细胞增殖的作用,其主要机制为ERα与丝裂原活化蛋白激酶 ( MAPK) 通路中的调节蛋白激酶( ERK) 发生交互作用( cross—talk),从而刺激细胞增殖, ERβ基因定位于染色体14q22-2,可能抑制肿瘤细胞的快速增殖【17】
3.5 ER、PR与分化型甲状腺癌组织类型的关系
        有部分研究提示 ER、PR的阳性率与组织学类型有关,即随着甲状腺癌的分化程度的降低而ER、PR的阳性率反而升高。本研究ER、PR的表达可能与DTC组织学类型无关,但ER、PR在乳头状癌的表达率小于ER、PR在滤泡状癌的表达率,这可能与不同实验体系样本量不同、实验体系抗原修复方法、实验体系的敏感性和特异性不同、及ER、PR阳性率判定结果不同有关。鉴于ER、PR在DTC甲状腺组织中的表达及其与DTC甲状腺组织增殖之间的关系,其拮抗剂可能作为临床上治疗DTC患者的新靶点[9]
3.6 ER、PR与淋巴结转移及包膜浸润的关系
       本研究发现ER、PR的表达水平与有无淋巴结转移及包膜浸润相关,提示ER、PR可能成为预测分化型甲状腺癌的预后一个指标,对于ER、PR阳性的甲状腺癌患者可能预示着肿瘤的局部晚期,国外文献报道,ERβ在有淋巴结转移和肿瘤甲状腺外侵犯的组织中表达水平上调,提示ERβ可能与甲状腺癌的侵袭性有关[7, 8]。与本研究一致,但研究局限性在于组织化学所应用的抗体并非针对ER亚单位的单克隆抗体。
 
第4章   结论
 
        分化型甲状腺癌的患病是相当复杂的过程,包括多步骤、多因素、复杂的病理过程,同时也涉及到了分子机制与免疫机制,但分化型甲状腺癌患病原理还不十分明确,分化型甲状腺癌的发生和进展、转移都是在多种基因参与和相互作用下完成的多步骤、多阶段过程。本实验通过研究ER、PR在分化型甲状腺癌与正常甲状腺组织及良性甲状腺疾病中的表达,得出ER、PR与有无淋巴结转移及有无包膜浸润具有统计学意义,这提示ER、PR的作用可能受到多种因素的调节,且调节机制和途径也多种多样,有待于今后扩大样本进一步研究。期望通过检测DTC甲状腺癌组织中ER、PR表达水平,可为临床DTC患者诊断、治疗及预后提供一定的理论参考依据。
 
 
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